產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)法酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），專用于定量檢測(cè)大鼠血清、血漿中的補(bǔ)體片斷 5a（C5a）含量。檢測(cè)范圍覆蓋 0.313-20 ng/mL，靈敏度達(dá) 0.16 ng/mL，適用于補(bǔ)體系統(tǒng)激活、炎癥反應(yīng)、過敏反應(yīng)及自身免疫病研究等領(lǐng)域。
產(chǎn)品名稱：大鼠補(bǔ)體片斷5a(C5a)elisa試劑盒
英文名稱：C5a ELISA Kit
產(chǎn)品規(guī)格：48T/96T
產(chǎn)品貨號(hào)：CS-6037E
檢測(cè)原理：
大鼠補(bǔ)體片斷 5a (C5a) ELISA 試劑盒的原理是?競(jìng)爭(zhēng)法?，通過固相載體包被抗原，樣本中抗原與固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特異性抗體，最后通過底物顯色反應(yīng)來定量檢測(cè)。
?固相化?：微孔板預(yù)先包被 C5a 人工抗原。
?結(jié)合?：加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本與特異性抗體混合液，C5a 與固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體。
?檢測(cè)?：加入 HRP 標(biāo)記的二抗，與結(jié)合在固相載體上的抗體形成復(fù)合物。
?顯色?：加入 TMB 底物，被 HRP 催化后由藍(lán)色變?yōu)辄S色。
?測(cè)定?：用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度 (OD 值)，濃度與 OD 值成反比。
實(shí)驗(yàn)步驟?：
?試劑準(zhǔn)備?：將試劑盒平衡至室溫(20-25℃)，洗滌緩沖液按1:19稀釋。標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋至所需濃度。
?加樣?：每孔加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣本，37℃孵育90分鐘。
?洗滌?：棄去液體，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后甩干，重復(fù)5次。
?加檢測(cè)抗體?：每孔加入100μL檢測(cè)抗體-HRP，37℃孵育60分鐘。
?洗滌?：同步驟3。
?顯色?：每孔加入90μL TMB底物A+B混合液，37℃避光孵育15分鐘。
?終止?：每孔加入50μL終止液，立即搖勻（顏色由藍(lán)變黃）。
?檢測(cè)?：450nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(OD值)，15分鐘內(nèi)完成。
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操作步驟?：
1.加樣孵育
每孔精準(zhǔn)加入 100μL 對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品 / 待測(cè)樣本，空白孔加等量；貼封板膜密封微孔板，置于 37℃恒溫孵育箱，避光孵育 90min，保證抗原抗體充分結(jié)合。
2.洗板
輕柔棄去孔內(nèi)液體，吸水紙上快速拍干；每孔加滿洗滌工作液，靜置浸泡 30s，甩干拍凈；重復(fù)洗滌5 次，去除未結(jié)合雜質(zhì)，降低背景值。
3.加酶結(jié)合物孵育
除空白孔外，每孔加入 100μL HRP 標(biāo)記特異性檢測(cè)抗體；輕微水平晃板混勻，重新封板，37℃避光恒溫孵育 60min。
4.二次洗板
重復(fù)上述洗板操作 5 次，嚴(yán)格拍干孔內(nèi)殘留液體，杜絕殘留洗液造成假陽性、數(shù)據(jù)偏差。
5.底物顯色
避光條件下，每孔加入 90μL TMB 底物顯色液，輕柔混勻；37℃避光精準(zhǔn)孵育 10~15min，此時(shí)液體逐步顯現(xiàn)藍(lán)色，顯色深淺與待測(cè)物含量正相關(guān)。
6.反應(yīng)終止
嚴(yán)格遵循加樣順序，每孔快速加入 50μL 酸性終止液，輕晃微孔板充分混勻，藍(lán)色即刻轉(zhuǎn)為黃色，終止酶促顯色反應(yīng)。
7.上機(jī)讀數(shù)檢測(cè)
加終止液后15min 內(nèi)，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔 450nm 波長(zhǎng)吸光度（OD 值）；以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、OD 值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合方程計(jì)算待測(cè)樣本目標(biāo)蛋白濃度。
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