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本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA），專用于定量檢測大鼠血清、血漿、尿液、胎盤組織中的 E3 濃度。檢測范圍覆蓋 0.313-20 ng/mL，靈敏度達 0.16 ng/mL，適用于雌性生殖、胎盤功能、妊娠模型及雌激素代謝研究。

核心原理：

固相化：微孔板預先包被抗大鼠 E3 抗體。

結合：加入標準品或樣本，E3 被固相抗體捕獲。

檢測：加入化的抗大鼠 E3 抗體和 HRP 標記親和素，形成抗體 - 抗原 - 酶標抗體復合物。

顯色：加入 TMB 底物，被 HRP 催化由藍色變為黃色。

測定：用酶標儀在 450nm 波長測定吸光度 (OD 值)，濃度與 OD 值成正比。

樣本要求：

1. 樣本類型與處理

血清：無熱源無菌采集，杜絕溶血、脂血污染；1000×g 離心 10 min 分離上清，-20℃分裝保存，嚴禁反復凍融。血漿：選用 EDTA / 檸檬酸鹽 / 肝素抗凝管采血混勻，離心去除血細胞取上清備用（部分試劑盒慎用肝素）。細胞上清：收集后 1000×g 離心 10 min 去除細胞碎片與雜質，-70~-80℃低溫保存。組織勻漿：預冷生理鹽水 / PBS 冰上制備勻漿，高速離心取澄清上清，-20℃避光分裝貯存。

2. 通用注意事項

1) 樣本嚴禁添加疊氮鈉（NaN?），會抑制 HRP 酶活性，導致顯色失效。

2) 所有樣本避免室溫久置，全程低溫操作，防止蛋白降解。

3) 溶血、渾濁、微生物污染樣本直接廢棄，干擾抗體抗原結合。

4) 細胞上清、低豐度指標樣本務必設置復孔，校正實驗誤差。

5) 檢測濃度超標時，僅用試劑盒配套稀釋液稀釋，匹配基質體系。

操作步驟：

1. 試劑準備

將試劑盒所有組分平衡至室溫（20–25℃，≥30min）；濃縮洗滌液按 1:19 稀釋配制工作液。

標準品用標準品稀釋液復溶，梯度稀釋，配置系列濃度梯度標準溶液，備用。

2. 實驗流程

加樣：設置空白孔、標準孔、樣本孔，每孔加入 100 μL 對應標準品 / 待測樣本，封板，37℃恒溫孵育 90 min。

洗滌：棄凈孔內液體，每孔加滿洗滌工作液，靜置 30 s，甩干拍凈，重復洗滌 5 次。

加酶結合物：每孔加入 100 μL HRP 標記檢測抗體，封板混勻，37℃孵育 60 min。

洗滌：重復上述洗滌步驟 5 次，拍干微孔。

顯色：每孔避光加入 90 μL TMB 底物顯色液，輕柔混勻，37℃避光顯色 15 min。

終止：按同等順序每孔快速加入 50 μL 終止液，輕晃混勻，溶液由藍轉黃。

讀數：15 min 內，酶標儀 450 nm 波長測定各孔 OD 值，擬合標準曲線計算樣本含量。

3. 關鍵質控要點

全程孵育使用專用封板膜，防止液體蒸發、交叉污染。

洗滌充分為實驗核心，殘留洗液易造成背景偏高、假陽性。

TMB 顯色液避光儲存，現用現加，嚴禁接觸氧化劑。

加終止液順序需與顯色加樣一致，避免局部色差、綠色殘留。

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